Руководство по иммунохроматографии

Конструкция иммунохроматографической тест-полоски

Рисунок 1. Типичная схема иммунохроматографической тест-полоски.

Тест-полоска ИХА содержит четыре ключевых элемента (слоя):

1.    Слой для внесения образца: Изготавливается из целлюлозы и/или стекловолокна, служит для внесения  образца биологической жидкости и дальнейшего его перемещения к остальным составляющим частям тест-полоски. Этот элемент обеспечивает равномерную транспортировку образца, а также его предварительную обработку  для отделения ненужных компонентов, коррекции pH и др.

2.    Слой с конъюгатом: Здесь на специальный фильтр нанесены меченые молекулы для биораспознавания аналита - конъюгат (антигены или антитела, конъюгированные с цветной меткой; обычно в качестве цветной метки используют  наночастицы коллоидного золота). Материал этого элемента обеспечивает быстрое высвобождение конъюгата при контакте с движущимся фронтом жидкости и поддержание   стабильности конъюгата на протяжении всего срока годности тест-полоски.

3.    Мембрана из нитроцеллюлозы: Специальный материал с нанесенными на него реагентами (антигенами или антителами) в виде  линий - тестовая линия и контрольная линия. Мембрана обеспечивает хорошее связывание с белковыми молекулами, минимизируя неспецифическую адсорбцию, что важно для высокой чувствительности и специфичности анализа.

4.    Адсорбирующий слой (впитывающая зона): Впитывает дошедший до нее фронт жидкости, поддерживая продвижение жидкости вдоль  мембраны и предотвращая ее обратный ток. Его способность впитывать и удерживать жидкость может значительно влиять на чувствительность анализа.

Все перечисленные элементы фиксируются в определенном порядке на пластиковой подложке с клеевым слоем.

Процесс производства тест-полосок для ИХА. Ключевые Этапы

1.Подбор антител и антигенов для определенного аналита; 

2. Изготовление реагента с цветной меткой  (конъюгата с коллоидным золотом)

3. Нанесение и фиксация меченного реагента на матрикс (слой) для  конъюгата.

4. Нанесение захватывающих антител на нитроцеллюлозную мембрану для , формирования тестовой и контрольной линий. 

5. Сборка всех компонентов на пластиковой подложке. 

6. Нарезка собранных листов на отдельные тест-полоски. Для удобства использования тест-полоски могут помещаться в пластиковые кассеты разной формы и др. устройства.

7. Упаковка в индивидуальные герметичные пакеты.

Проведение анализа с помощью иммунохроматографических экспресс-тестов 

1)  Добавление образца и буфера на зону для образца. 

2) Ожидание в течение 5–15 минут, пока фронт жидкости  пройдёт по мембране и появятся  цветные тестовая и контрольная линии. 

3) Визуальная оценка результата. 

Форматы ИХА: 

Иммунохроматографический анализ  включает различные варианты, использующие  разные комбинации меченых  антигенов и антител, могут применяться разные  метки, системы обнаружения и приложения. Различают три основных типа ИХА в зависимости от формата обнаружения:

Сэндвич-метод

В данном формате антитела, конъюгированные с цветной меткой (наночастицами или флуоресцентными красителями), фиксируются на слое для конъюгата. При добавлении образца и буферного раствора конъюгат смывается  потоком жидкости связывается с аналитом (антигеном). Захватывающие антитела для целевого аналита зафиксированы на тестовой линии. Когда фронт жидкости доходит до него, с ним связывается комплеск антиген-меченое антитело Вторичные антитела для захвата избытка конъюгата фиксируются на контрольной линии (рис. 2).

Рисунок 2. Принципиальная схема сэндвич-ICA.

Есть другая модификация классического сэндвич-метода - принцип двойного антигена, или двухсайтовый метод. Он используется для выявления антител в образце. При этом один антиген нанесен на мембрану, а другой, конъюгированный с цветной меткой - находится на слое для конъюгата.

Конкурентный анализ

Конкурентный формат представлен на Рис. 3. Раствор с целевым аналитом наносится на слой для образца,  жидкость доходит до слоя с конъюгатом, при этом меченные антитела гидратируются, активируются, захватывают аналит и перемещаются дальше с потоком жидкости к тестовой линии. На тестовой линии заранее зафиксирован антиген (тот же аналит), который мог бы связаться с  мечеными антителами, но они уже заняты конкурентом - связавшимся с ними аналитом из образца. Реакции не происходит (окрашенная тестовая линия не образуется). Наконец фронт жидкости доходит до  контрольной линии. Она содержит заранее зафиксированные вторичные антитела, способные связываться с меченными антителами (образуется окрашенная контрольная линия).

Этот формат идеально подходит для низкомолекулярных соединений (например, наркотиков), которые из-за маленького размера  не могут взаимодействовать с двумя антителами одновременно. Отсутствие окраски на тестовой линии указывает на присутствие аналита, и наоборот - наличие окраски на тестовой и контрольной линиях свидетельствует об отрицательном результате. Это главное отличие конкурентного анализа от сэндвич-метода.

Рисунок 3. Принципиальная схема конкурентного ИХА.

Формат мультиплексного обнаружения

Формат мультиплексного обнаружения применяется для идентификации более чем одного целевого аналита, и анализ проводится на полоске, на которой количество тестовых линий соответствует числу определяемых аналитов. Очень важно иметь возможность выявлять несколько аналитов одновременно в одинаковых условиях. Мультиплексное обнаружение особенно полезно в клинической диагностике, когда требуется определить несколько взаимосвязанных аналитов для оценки стадии заболевания. ИХА тесты могут быть разработаны в разных форматах, например, путем удлинения тест-полоски и увеличения количества тестовых линий на ней, создания других структур из нескольких тест-полосок, расположенных параллельно, в виде звезд или Т-образных форм. Это зависит от числа целевых аналитов.

Иммунохроматографический  анализ - это проверенная и очень эффективная технология, применяемая в различных ситуациях в медицинских учреждениях или в полевых и домашних условиях.

Преимущества ИХА широко известны:

·         Относительная простота создания – технологии и процессы уже разработаны и доступны. 

·         Легкость масштабирования для массового производства. 

·         Стабильность - срок хранения 12-24 месяца при комнатной температуре. 

·         Простота и быстрота использования: минимум операций и интерпретаций, зависящих от оператора; возможность бесприборного считывания результата. 

·         Возможность обработки малых объемов проб различных типов. 

·         Возможность интеграции с бортовой электроникой, системами считывания и информационными системами. 

·         Относительно низкая стоимость и короткие сроки разработки и утверждения. 

·         Присутствие на рынке и признание – минимальное обучение, требуемое для пользователей и регулирующих органов. 

Тем не менее, традиционно используемые ИХА экспресс-тесты также имеют некоторые ограничения по аналитическим характеристикам, в первую очередь, по чувствительности и воспроизводимости. Некоторые из этих проблем включают:

·         Отсутствие точного дозирования  объема пробы. 

·         Мультиплексирование: сложность одновременного анализа нескольких маркеров. 

·         Сложная интеграция с бортовой электроникой и встроенными функциями контроля качества. 

·         Проблемы чувствительности в некоторых системах. 

·         Недостаточно высокая воспроизводимость от теста к тесту - это ограничивает их применение в качестве количественных методов. 

Благодаря быстрому процессу тестирования и относительно высокой чувствительности и специфичности ИХА тесты получили широкое распространение на различных рынках. Ниже на рисунке 4 представлены некоторые сферы применения ИХА.

Рисунок 4. Применение иммунохроматографического анализа.

Источники: